基因工程涉及眾多的工具酶可粗略的分為限制酶，連接酶，聚合酶，核酸酶和修飾酶五大類。其中，以限制性核酸內切酶和DNA連接酶在分子克隆中的作用為突出。
生物體內能識別并切割特異的雙鏈DNA序列的一種內切核酸酶。它是可以將外來的DNA切斷的酶，即能夠限制異源DNA的侵入并使之失去活力，但對自己的DNA卻無損害作用，這樣可以保護細胞原有的遺傳信息。由于這種切割作用是在DNA分子內部進行的，故名限制性內切酶(簡稱限制酶)
限制性內切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA內切酶之分，Ⅱ型能嚴格識別核酸序列，并在識別區(qū)內特定的核苷酸處切開DNA雙鏈。故通常所指都是Ⅱ型限制性DNA內切酶。識別分四核苷酸，五核苷酸，八核苷酸和六核苷酸，其中以六核苷酸為主，其序列旋轉對稱。切口分黏性末端和平末端，產生3′-OH和5′-P末端。內切酶品種多，使用時應注意溫度、緩沖液用量(一般1μg DNA/2-5單位酶)等反應條件。
它是一種封閉DNA鏈上缺口酶，借助ATP或NAD水解提供的能量催化DNA鏈的5'-PO4與另一DNA鏈的3'-OH生成磷酸二酯鍵。但這兩條鏈必須是與同一條互補鏈配對結合的(T4DNA連接酶除外)，而且必須是兩條緊鄰DNA鏈才能被DNA連接酶催化成磷酸二酯鍵。
連接酶有T4噬菌體DNA連接酶、T4噬菌體RNA連接酶、大腸埃希菌DNA連接酶等。DNA連接酶可連接平端，也連接粘端。反應需有Mg和ATP存在，pH7.5-7.6。適溫度37℃，30℃以下活性明顯下降，但考慮到被連接DNa 的穩(wěn)定性和粘性末端的退火溫度，一般平端連接用20-25℃，粘端連接用12℃左右。
聚合酶有DNA聚合酶(以DNA為模板合成DNA大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ，大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ大片段(Klenow大片段)，T4或T7噬菌體DNA聚合酶等);RNA聚合酶(以DNA為模板合成RNA，T7或T3噬菌體RNA聚合酶);逆轉錄酶(以RNA為模板合成DNA，除RNA病毒中發(fā)現外，發(fā)現大腸埃希菌DNA聚合酶Ⅰ和Taq DNA聚合酶都有逆轉錄活性)。
大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ具有5′→3′聚合酶活性和5′→3′，3′→5′外切酶活性。Klenow片段是DNA聚合酶Ⅰ被枯草桿菌酶作用產生的一個大片段，有5′→3′聚合酶和3′→5′外切酶活性，無5′→3′外切酶活性。可用于缺口翻譯(Nick translation)法標記核酸，也可用于DNA序列測定，修補DNA鏈等。